O universo conhecido é controlado pela Aliança Terrestre (que controla Terra, Marte e Io) e cinco grandes impérios alienígenas: o Império Centauri, o Regime Narn, os Minbaris, os Vorlons e a Liga dos Mundos não Alinhados, que reúne uma dezena de mundos menores e tem menor influência política.
Os centauri são modelados a partir da nobreza européia, em especial no momento de decadência. Fica claro a saudade deste povo de dias melhores, quando o império era maior e as colônias várias. Na estação são representados por Londo Mollari, o embaixador, e Vir Cotto, auxiliar.
Os narns são um povo belicoso que já foram colônia escrava do Império Centauri. Seu representante da estação estação é G’kar o embaixador, auxiliado por Na’Toth. Apresentados inicialmente como moralmente questionáveis no telefilme Babylon 5 – The gathering, ao longo da série se percebe que não são isso, e não é uma mudança brusca, mas uma evolução, já que são um povo profundamente religioso e comprometido com crenças e a palavra.Os minbaris são uma raça que travou uma guerra com a Terra e se renderam quando estavam a momentos da vitória, graças a um terrível segredo. Na verdade, a guerra começou com um engano, quando terrestres não compreenderam uma tentativa de contato e mataram o líder minbari. Filosoficamente superior, o povo minbari é controlado pelo “Conselho Cinza”, que é composto de três membros de cada uma das três castas: a religiosa, a guerreira e a trabalhadora. Foi o Conselho Cinza que ordenou a rendição e não explicou os motivos para a população. São representados por Deleen, a embaixadora, e Lennier, o auxiliar.
Os vorlons são representados por Kosh, um ser de energia que é envenenado no telefilme piloto (The gathering), e a partir de então só é visto em sua armadura. Com conceitos muito superiores aos humanos, os vorlons são inexplicáveis e nunca respondem a uma pergunta de maneira direta. Já estiveram na Terra ao longo de nossa história, especialmente no final do século XIX quando raptaram um certo assassino que matou umas pobres moças em Whitechappel, Londres.Os humanos na série são representados por Jefrey Sinclair, comandante da estação no telefilme piloto e na primeira temporada, Susan Ivanova, segunda em comando, Michael Garibaldi, chefe de segurança da estação, Dr. Stephen Franklin, chefe da divisão médica e Tália Winters, uma telepata associada à Psi Corps, uma corporação que encontra, coleta e obriga os telepatas da Terra a trabalharem para ela. A Psi Corps responde diretamente ao gabinete da presidência da Terra e seu funcionário mais conhecido e odiado na série é Alfred Bester. No piloto a telepata residente é Lyta Alexander, e há uma trama que diz que ela foi afastada da estação por ter feito um contato mental com os Vorlons, cujos corpos nunca foram vistos. Lyta retorna à série no final da segunda temporada, e tornar-se permanente na terceira, quarta e quintas temporadas.
