O universo conhecido é controlado pela Aliança Terrestre (que controla Terra, Marte e Io) e cinco grandes impérios alienígenas: o Império Centauri, o Regime Narn, os Minbaris, os Vorlons e a Liga dos Mundos não Alinhados, que reúne uma dezena de mundos menores e tem menor influência política.
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Os minbaris são uma raça que travou uma guerra com a Terra e se renderam quando estavam a momentos da vitória, graças a um terrível segredo. Na verdade, a guerra começou com um engano, quando terrestres não compreenderam uma tentativa de contato e mataram o líder minbari. Filosoficamente superior, o povo minbari é controlado pelo “Conselho Cinza”, que é composto de três membros de cada uma das três castas: a religiosa, a guerreira e a trabalhadora. Foi o Conselho Cinza que ordenou a rendição e não explicou os motivos para a população. São representados por Deleen, a embaixadora, e Lennier, o auxiliar.
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Os humanos na série são representados por Jefrey Sinclair, comandante da estação no telefilme piloto e na primeira temporada, Susan Ivanova, segunda em comando, Michael Garibaldi, chefe de segurança da estação, Dr. Stephen Franklin, chefe da divisão médica e Tália Winters, uma telepata associada à Psi Corps, uma corporação que encontra, coleta e obriga os telepatas da Terra a trabalharem para ela. A Psi Corps responde diretamente ao gabinete da presidência da Terra e seu funcionário mais conhecido e odiado na série é Alfred Bester. No piloto a telepata residente é Lyta Alexander, e há uma trama que diz que ela foi afastada da estação por ter feito um contato mental com os Vorlons, cujos corpos nunca foram vistos. Lyta retorna à série no final da segunda temporada, e tornar-se permanente na terceira, quarta e quintas temporadas.